식물 직접 PCR 키트

고양이 번호: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit는 식물의 잎, 씨앗 등을 직접 증폭하는데 적합하며, 다당류와 폴리페놀을 포함하지 않는 식물 시료의 고처리량 스크리닝에 사용할 수 있습니다.방향진화에 기초한 직접 증폭 DNA 중합효소는 식물의 PCR 억제제에 대해 우수한 내성을 가지고 있습니다.한편, 5kb 이내의 DNA 단편 증폭에 적합한 높은 증폭 성능을 유지합니다.키트에 포함된 고유한 용해 완충액 A를 사용하여 신선하거나 냉동된 식물 조직을 용해할 수 있습니다.조작이 간편하고, 용해물을 정제 없이 증폭용 템플릿으로 사용할 수 있습니다.이 시스템에는 냉동과 해동을 반복한 후에도 미정제 시료를 효과적으로 증폭시킬 수 있는 보호제가 포함되어 있습니다.2 × Plant Direct Master Mix는 증폭 반응을 수행하기 위해 프라이머와 템플릿만 추가하면 되므로 피펫팅 작업이 줄어들고 검출 처리량과 결과의 재현성이 향상됩니다.

구성요소

*Plant Direct Lysis Buffer B는 선택 시약으로, 시료의 보관 기간을 연장하기 위해 Plant Direct Lysis Buffer A를 중화하는 데 사용됩니다.실제 상황에 따라 활용이 가능합니다.

보관 조건

2 × Plant Direct Master Mix, -30 ~ -15℃에서 보관하고 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오.직접 용해 완충액을 심고, -30 ~ -15℃ 또는 2 ~ 8℃에 보관하세요.

실험 과정

샘플 처리–식물의 잎

직접 방법:어린 잎을 사용하는 것이 좋습니다.직경이 0.5 – 3 mm로 고정된 홀 펀치를 사용하여 작고 균일한 샘플a을 얻은 다음 샘플을 PCR 시스템에 직접 추가합니다(50 μl 시스템 권장).샘플이 튜브 벽에 닿지 않고 PCR 용액 안에 있는지 확인하십시오.긴 단편과 복잡한 샘플을 증폭하기 위해 직접 PCR을 사용하는 경우 더 작은 직경(0.5 – 1 mm)의 샘플을 주형으로 사용하면 더 나은 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.

분쇄 용해 방법:어린 잎을 사용하는 것이 좋습니다.작은 잎 조각(직경 약 1~3mm)을 취하여 20μl Plant Direct Lysis Buffer Ab에 넣고 최대한 갈아줍니다. (이 단계는 100μl 피펫 팁으로 잎을 짜내면 됩니다. 샘플을 으깬다).더 많은 양의 잎 조직을 사용하는 경우(7mm를 초과하지 않음) 희석 완충액의 양을 50μl로 늘립니다.잎이 갈아지면 용액이 녹색으로 나타나야 합니다.간단한 원심분리 후 상등액 1 μl를 반응 주형으로 PCR 시스템에 추가합니다.

열 용해 방법:어린 잎을 사용하는 것이 좋습니다.작은 잎 조각(직경 약 1~3mm)을 취해 20μl Plant Direct Lysis Buffer A에 넣고 95°C에서 5~10분간 가열합니다.용해가 어려운 잎의 경우 용해 시간을 적절하게 연장할 수 있습니다(20분 이내).더 많은 양의 잎 조직을 사용하는 경우(7mm를 초과하지 않음) 희석 완충액의 양을 50μl로 늘립니다.가열 후 잠시 원심분리하고 상등액 1 μl를 반응 주형으로 PCR 시스템에 첨가합니다b.

샘플 처리–식물 씨앗

분쇄 용해 방법:메스를 사용하여 직경 5mm의 종자를 자르고 Plant Direct Lysis Buffer A 100μl에 첨가한 후 피펫 팁이나 기타 도구로 시료를 갈아줍니다.짧게 휘젓고 실온에 3~5분 동안 방치합니다.종자 샘플이 희석 완충액에 잠겨 있는지 확인하십시오.간단한 원심분리 후 상청액 1 μl를 반응 템플릿으로 PCR 시스템에 추가합니다.

열 용해 방법:메스를 사용하여 직경 5mm의 씨앗을 자르고 Plant Direct Lysis Buffer A 100μl에 첨가한 후 95°C에서 5~10분간 가열합니다.용해가 어려운 잎의 경우 용해 시간을 적절하게 연장할 수 있습니다(30분 이내).가열 후 잠시 원심분리하고 상청액 1 μl를 반응 주형으로 PCR 시스템에 첨가합니다b.

ㅏ.가위나 기타 도구를 사용하여 적절한 크기의 샘플을 절단할 수도 있습니다.펀치나 가위를 재사용하는 경우 샘플 간 교차 오염을 방지하기 위해 매번 사용하기 전에 2% 차아염소산나트륨 용액으로 세척해야 합니다.

비.사용하기 전에 Plant Direct Lysis Buffer가 완전히 녹았는지 확인하십시오.완충액이 점성이 있거나 침전물이 있는 경우에는 37℃로 가열하여 완전히 녹인 후 사용할 수 있습니다.

씨.반응 시스템 내 템플릿의 부피는 첨가되는 식물 재료와 희석제의 부피 차이에 따라 적절하게 조정될 수 있습니다.

식물 직접 용해 완충액

본 제품에 함유된 Plant Direct Lysis Buffer A는 대부분의 식물 조직의 게놈을 방출하도록 엄격하게 최적화되었으며 4℃에서 조식물의 단기 보관에 적합합니다.검체를 장기간(예: 1~2개월) 보관해야 하는 경우 상청액을 새 EP 튜브에 옮겨 -20℃에 보관하는 것이 좋습니다.검체를 보다 안정적으로 보관하려면 옮겨진 상등액에 동량의 Plant Direct Lysis Buffer B를 첨가하고 잘 섞은 후 -20℃에 보관하세요.안정적인 보관 시간은 식물 샘플 및 상태에 따라 다릅니다.

반응 시스템

ㅏ.Mg이 함유되어 있습니다.²⁺최종 농도는 2 mM입니다.

비.각 프라이머의 최종 농도는 0.4μM을 사용하는 것이 좋습니다.프라이머를 과도하게 사용하면 비특이적 증폭이 증가합니다.

씨.사용되는 샘플의 양은 실제 상황에 따라 조정될 수 있습니다.미정제 용해 시료의 단일 반응에 사용되는 양은 전체 반응 부피의 2%~20% 사이에서 조정될 수 있습니다.너무 많은 샘플을 사용하면 증폭 실패가 발생할 수 있습니다.

반응 프로그램

ㅏ.초기 변성(98℃, 5분)은 식물 조직의 용해를 촉진하여 PCR 증폭에 사용할 수 있는 게놈 DNA를 방출합니다.시간을 단축하거나 온도를 낮추지 마십시오.

비.프라이머 Tm 값과 동일하게 설정하거나 Tm 값보다 2~4℃ 높게 설정하는 것이 좋습니다.본 제품에 사용된 직접 증폭 DNA 중합효소는 기존의 Taq DNA 중합효소와 다르며 반응 어닐링 온도에 대한 특별한 요구 사항이 있습니다. 높은 어닐링 온도를 사용하면 비특이적 증폭을 효과적으로 줄이고 증폭 효율을 향상시킬 수 있습니다.템플릿이 복잡한 경우 어닐링 온도를 조정하고 확장 시간을 연장하여 효율적인 증폭을 달성할 수 있습니다.

씨.증폭 산물의 길이가 1kb 이하인 경우 연장 시간은 30초/kb로 설정됩니다.증폭 산물의 길이가 1kb보다 큰 경우 연장 시간은 60초/kb로 설정됩니다.

디.복잡한 시료나 증폭 수율이 낮은 시료의 경우 주기 수를 40~50주기까지 적절하게 늘릴 수 있습니다.

응용

식물 조직의 직접 증폭과 다당류 및 폴리페놀을 포함하지 않는 식물 시료의 고처리량 스크리닝에 적용 가능합니다.

노트

연구용으로만 사용하세요.진단 절차에 사용하지 마십시오.

1. 조식물 증폭 또는 직접 증폭의 경우 시스템, 프라이머 및 작동이 올바른지 확인하기 위해 실험을 시작하기 전에 정제된 게놈 DNA를 양성 대조군으로 사용하는 것이 좋습니다.

2. 본 키트에 사용된 직접 증폭 DNA 중합효소는 강력한 교정 활성을 가지고 있습니다.TA 클로닝을 수행해야 하는 경우, 아데닌을 첨가하기 전에 DNA를 정제하는 것이 좋습니다.

3. 프라이머 디자인 지침:

ㅏ.프라이머의 3' 말단의 마지막 염기는 G 또는 C인 것을 권장합니다.

비.프라이머 3' 말단의 마지막 8개 염기에서 연속적인 불일치가 발생하지 않도록 해야 합니다.씨.프라이머의 3' 말단에 헤어핀 구조를 피하십시오.

디.Forward Primer와 Reverse Primer의 Tm 값의 차이는 1℃ 이내이어야 하며, Tm 값은 60~72℃로 조정되어야 합니다. (Tm 값을 계산하려면 Primer Premier 5를 권장합니다.)

이자형.템플릿과 일치하지 않는 추가 추가 프라이머 시퀀스는 프라이머 Tm 값을 계산할 때 포함되어서는 안 됩니다.

에프.프라이머의 GC 함량은 40% -60%인 것이 좋습니다.

g.프라이머 내 A, G, C, T의 전체 분포는 최대한 균일해야 합니다.GC 또는 AT 함량이 높은 지역은 사용하지 마세요.

시간.프라이머 내에서 또는 두 프라이머 사이에 5개 이상의 염기로 구성된 상보적 서열이 존재하지 않도록 하고, 두 프라이머의 3' 말단에 3개 이상의 염기로 구성된 상보적 서열이 존재하지 않도록 하십시오.

나.NCBI BLAST 기능을 이용하여 프라이머의 특이성을 확인하여 비특이적 증폭을 방지하세요.