EndoFree 플라스미드 맥시 키트
이 키트는 박테리아를 용해하기 위해 향상된 SDS-알칼리 용해 방법을 사용하여 밤새 배양한 박테리아 용액 150~300ml에서 추출하는 데 적합합니다.조 추출물은 독특한 내독소 제거제와 선택적으로 결합되고 원심분리에 의해 분리되어 내독소를 제거합니다.그러면 실리카겔 막은 고염 및 저pH 조건에서 용액 내의 플라스미드 DNA와 선택적으로 결합합니다.그 다음에는 불순물과 기타 박테리아 성분을 제거하기 위해 세척 완충액을 추가합니다.마지막으로, 저염, 고pH 용출 완충액을 사용하여 실리콘 매트릭스 막에서 순수한 플라스미드 DNA를 용출합니다.실리카겔막은 특수한 흡착막을 채용하고 있으며 컬럼과 컬럼의 흡착량 차이가 매우 적고 반복성이 좋습니다.페놀, 클로로포름 및 기타 독성 시약이 필요하지 않으며 에탄올 침전 단계도 필요하지 않습니다.이 키트를 사용하면 0.2~1.5mg의 순수 high-copy 플라스미드 DNA를 80%~90%의 추출율로 빠르게 추출할 수 있습니다.이 키트는 엔도톡신을 제거하는 독특한 공정 방식을 사용하며, 엔도톡신 함량이 극히 낮고 세포 형질감염 효과가 우수합니다.추출된 플라스미드는 효소 분해, PCR, 시험관 내 전사, 형질전환, 서열 분석 및 기타 분자 생물학 실험에 직접 사용될 수 있습니다.
보관 조건
RNaseA는 -30~-15℃에서 보관하고 0℃ 이하에서 운송해야 합니다.
엔도톡신 스캐빈저는 2~8℃에서 1개월간 보관이 가능하며, 장기보관 시에는 -30~-15℃에서 보관이 가능합니다.0℃ 이하에서 운송됩니다.
기타 구성품은 실온(15~25℃)에서 보관하고 실온에서 운송해야 합니다.
구성요소
| 구성요소 | 10RXNS |
| RNase A | 750μL |
| 버퍼 P1 | 75ml |
| 버퍼 P2 | 75ml |
| 버퍼 P4 | 75ml |
| 내독소 제거제 | 25ml |
| 버퍼 비밀번호 | 2×22ml |
| 완충 결핵 | 20ml |
| FastPure DNA Maxi 컬럼(각각 50ml 수집 튜브에 들어 있음) | 10 |
| 내독소가 없는 수집 튜브 | 2×5 |
RNaseA:10 mg/ml, RNA 제거에 사용됩니다.
버퍼 P1:박테리아 현탁 완충액인 경우 처음 사용하기 전에 RNaseA를 완충액 P1에 추가하십시오.
버퍼 P2:박테리아 용해 완충액(SDS/NaOH 함유).
버퍼 P4:중화 완충액.
내독소 제거제:조 플라스미드 추출물에서 내독소를 효과적으로 제거합니다.
버퍼 비밀번호:완충액을 세척하고, 처음 사용하기 전에 규정된 양의 에탄올을 첨가하십시오.
완충 결핵:용출 버퍼.
FastPure DNA Maxi 컬럼:플라스미드 DNA 흡착 컬럼.
수집 튜브 50ml:여과액 수집 튜브.
내독소가 없는 수집 튜브:플라스미드 DNA 수집 튜브.
준비된 재료
무수 에탄올, 이소프로판올, 50ml 둥근 바닥 원심분리 튜브 및 50ml 무내독소원심분리기 튜브.
응용
본 제품은 150 - 300 ml의 세균용액으로부터 대규모 플라스미드 추출에 적합한 제품입니다.밤새 배양하였다.
실험 과정
1. 밤새 배양한 세균용액 150~200ml(300ml 이하)를 취하여 100℃에서 원심분리한다.1~2분 동안 약 11,000rpm(12,000×g).상층액을 버리고 박테리아를 수집합니다.
Δ 50ml 이상의 세균용액을 수집할 경우 동일한 50ml 튜브에 세균용액 첨가, 원심분리, 상청액 폐기 및 기타 단계를 거쳐 세균을 채취할 수 있다.
여러 번.
2. 원심분리기에 Buffer P1(Buffer P1에 RNaseA가 추가되었는지 확인하세요) 7.5ml를 추가합니다.박테리아가 들어 있는 튜브에 넣고 볼텍스나 피펫팅으로 완전히 섞습니다.
Δ 이 단계에서 박테리아를 완전히 재현탁하는 것은 수율에 매우 중요하며 재현탁 후 박테리아 덩어리가 없어야 합니다.완전히 혼합되지 않은 박테리아 덩어리가 있으면 용해에 영향을 미쳐 수율과 순도가 낮아집니다.박테리아 용액의 OD600이 0.65인 경우 박테리아 용액 150ml에서 추출할 때 완충액 P1 7.5ml를 사용하는 것이 좋습니다.OD600이 0.75인 경우 버퍼 P1 8ml를 사용해야 하며 이에 따라 버퍼 P2 및 P4의 용량을 변경해야 합니다.박테리아 용액의 용량을 200ml로 늘리는 경우,버퍼 P1, P2, P4의 볼륨은 비례적으로 증가합니다.
3. 2단계의 세균 현탁액에 완충액 P2 7.5ml를 추가하고 6~8분간 위아래로 가볍게 섞습니다.4~5분 동안 실온에서 배양합니다.
Δ 부드럽게 뒤집어서 완전히 섞입니다.소용돌이로 인해 게놈 DNA 단편화가 발생하여 추출된 플라스미드에 게놈 DNA 단편이 생성됩니다.이때 용액은 점성이 있고 반투명해지며, 이는 박테리아가 완전히 용해되었음을 나타냅니다.플라스미드의 파괴를 방지하려면 지속 시간이 5분을 초과해서는 안 됩니다.용액이 투명하지 않으면 박테리아가 너무 많아불완전한 용해이므로 박테리아의 양을 적절하게 줄여야 합니다.
4. 7.5ml의 완충액 P4를 3단계의 박테리아 현탁액에 추가하고 즉시 6~8회 부드럽게 뒤집어 용액이 완충액 P2를 완전히 중화할 수 있도록 합니다.이때 흰색의 응집성 침전물이 나타나야 합니다.약 11,000rpm(12,000×g) 이상의 속도로 10~15분 동안 원심분리한 후 상청액을 조심스럽게 새로운 50ml 둥근 바닥 원심분리 튜브(자체 제작)에 넣고 피펫팅합니다.떠다니는 흰색 침전물을 흡인합니다.
Δ 버퍼 P4를 추가하고 즉시 뒤집어 잘 혼합합니다.중화에 영향을 줄 수 있는 국소 침전의 생성을 방지하기 위해 흰색 침전물이 용액 전체에 고르게 분포될 때까지 튜브를 세워 두십시오.원심분리 전에 균일한 흰색 응집 침전물이 없고 원심분리 후 상층액이 맑지 않은 경우 튜브를 사용할 수 있습니다.5분 더 원심분리했다.
5. 4단계의 상등액에 엔도톡신 스캐빈저 0.1배(상등액 부피의 10%, 약 2.2ml)를 첨가하고 뒤집어서 혼합한다.용액을 얼음통에 넣거나 으깬 얼음(또는 냉장고 냉동고)에 용액이 탁한 상태에서 맑고 투명하게 변할 때까지(또는 여전히 남아 있을 때까지 5분 동안 넣습니다.)약간 탁함), 때때로 여러 번 혼합합니다.
Δ 내독소 제거제를 상등액에 첨가한 후 상등액은 탁해지지만얼음 욕조에서 식힌 후 상등액은 투명해지거나 약간 탁해져야 합니다.
6. 상등액을 실온(>25℃)에 10~15분간 방치하면 다음과 같이 탁해집니다.온도가 실온으로 증가합니다.그런 다음 상청액을 뒤집어서 혼합해야 합니다.
Δ 실온이 낮거나 추출 시간을 단축하고 싶을 경우 상등액을 37~42℃ water Bath에서 5~10분 동안 배양한 후 상등액을 처리한 후 다음 단계를 진행할 수 있습니다.혼탁해집니다.
7. 상등액을 실온(25℃ 이상)에서 10분간 약 11,000rpm(12,000×g)으로 원심분리하여 상을 분리합니다.상부 수성층에는 DNA가 포함되어 있고 하부 파란색 유상층에는 내독소 및 기타 불순물이 포함되어 있습니다.전송DNA가 포함된 수성상을 새로운 튜브로 옮기고기름진 층을 버리십시오.
Δ 효과적인 상 분리가 이루어지지 않으므로 원심분리 시 온도는 25℃ 이상이어야 합니다.온도가 너무 낮으면 발생합니다.
Δ 상분리가 효과적이지 않은 경우 원심분리 온도를 30℃로 조절하고,원심분리 시간은 15분까지 늘릴 수 있습니다.
Δ 파란색 기름층에는 엔도톡신 및 기타 불순물이 포함되어 있으므로 빨지 마십시오.
기구
재현탁 용해 중화
◇ 버퍼 P1 7.5ml 추가
◇ 7.5ml 버퍼 P2 추가
◇ 버퍼 P4 7.5ml 추가
내독소 제거
◇엔도톡신 스캐빈저 상등액량의 0.1배 첨가
바인딩 및 세탁
◇ 이소프로판올 양의 0.5배 첨가
◇ Buffer PW 10ml 추가
◇ Buffer PW 10ml 추가
용출
◇ Buffer TB 또는 내독소가 없는 ddH2O를 1~2ml 추가합니다.
