M-MLV Neoscript 역전사효소
Neoscript 역전사효소는 Moloney 쥐 백혈병 바이러스 기원의 M-MLV 유전자와 대장균에서 발현되는 돌연변이 스크리닝을 통해 얻은 역전사효소입니다.이 효소는 RNase H 활성을 제거하고 온도 내성이 더 높으며 고온 역전사에 적합합니다.따라서 cDNA 합성에 있어 RNA 고수준 구조와 비특이적인 요인의 불리한 영향을 제거하는데 도움이 되며, 더 높은 안정성과 역전사 합성 능력을 가지고 있습니다.효소는 더 높은 안정성과 역전사 합성 능력을 가지고 있습니다.
구성요소
1.200 U/μL Neoscript 역전사효소
2.5 × 첫 번째 가닥 버퍼(옵션)
* 5 × First-Strand Buffer에는 dNTP가 포함되어 있지 않습니다. 반응 시스템을 준비할 때 dNTP를 추가하십시오.
권장 애플리케이션
1.원스텝 qRT-PCR.
2.RNA 바이러스 검출.
보관상태
-20°C로 장기간 보관시에는 잘 섞어서 사용하시고, 잦은 동결-해동은 피해주세요.
단위 정의
하나의 장치는 폴리(A)·올리고(dT)를 사용하여 37°C에서 10분 안에 1nmol의 dTTP를 통합합니다.25템플릿/프라이머로.
품질 관리
1.SDS-PAGE 전기영동 순도는 98% 이상입니다.
2.증폭 감도, 배치 간 제어, 안정성.
3.외인성 뉴클레아제 활성 없음, 외인성 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 오염 없음
첫 번째 연쇄 반응 솔루션을 위한 반응 설정
1.반응 혼합물의 준비
| 구성요소 | 용량 |
| 올리고(dT)12-18 뇌관 또는 무작위 프라이머ㅏ 또는 유전자 특이적 프라이머b | 50pmol |
| 50pmol(20-100pmol) | |
| 2pmol | |
| 10mM dNTP | 1μL |
| 템플릿 RNA | 총 RNA≤ 5μg;mRNA ≤ 1μg |
| RNase가 없는 dH2O | 10μL까지 |
노트:a/b: 실험 요구사항에 따라 다양한 유형의 프라이머를 선택하세요.
2.65°C에서 5분간 가열한 후 얼음 위에서 2분간 급속 냉각합니다.
3.위 시스템에 다음 구성 요소를 총 20μL의 부피로 추가하고 부드럽게 섞습니다.
| 구성요소 | 용량 (μL) |
| 5 × 첫 번째 가닥 버퍼 | 4 |
| Neoscript 역전사효소(200 U/μL) | 1 |
| RNase 억제제(40U/μL) | 1 |
| RNase가 없는 dH2O | 20μL까지 |
4.다음 조건에 따라 반응을 진행해주세요.
(1) Random Primer를 사용할 경우에는 25℃에서 10분, 그 후 50℃에서 30~60분 동안 반응시켜야 합니다.
(2) Oligo dT 또는 특정 프라이머를 사용하는 경우에는 50℃에서 30~60분 동안 반응을 진행해야 합니다.
5.95℃에서 5분간 가열하여 Neoscript Reverse Transcriptase를 비활성화시키고 반응을 종결시킨다.
6.역전사 산물은 PCR 반응과 형광 정량 PCR 반응에 직접 사용하거나 -20℃에서 장기간 보관할 수 있습니다.
PCR R반응：
1.반응 혼합물의 준비
| 구성요소 | 집중 |
| 10 × PCR 버퍼(dNTP 없음, Mg²+ 없음) | 1× |
| dNTP(dNTP당 10mM) | 200μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4mM |
| Taq DNA 중합효소(5U/μL) | 2-2.5U |
| 프라이머 1(10μM) | 0.2-1μM |
| 프라이머 2(10μM) | 0.2-1μM |
| 주형ㅏ | 10% 이하 1차 연쇄 반응 용액(2μL) |
| ddH2O | 50μL까지 |
노트:a: 1차 연쇄반응 용액을 너무 많이 첨가할 경우 PCR 반응이 저해될 수 있습니다.
2.PCR 반응 절차
| 단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
| 사전 변성 | 95℃ | 2~5분 | 1 |
| 변성 | 95℃ | 10~20초 | 30-40 |
| 가열 냉각 | 50-60℃ | 10~30초 | |
| 확대 | 72℃ | 10~60초 |
노트
1.42℃~55℃ 범위의 역전사 온도 최적화에 적합합니다.
2.안정성이 더 좋고 고온 역전사 증폭에 적합합니다.또한, RNA의 복잡한 구조 영역을 효율적으로 통과하는 데 유리합니다.또한, 그것은1단계 다중 형광 정량 RT-PCR 검출에 적합합니다.
3.다양한 PCR 증폭효소와의 호환성이 좋아 고감도 RT-PCR 반응에 적합합니다.
4.고감도 one-step 형광 정량 RT-PCR 반응에 적합하며 저농도 템플릿의 검출 속도를 효과적으로 향상시킵니다.
5.cDNA 라이브러리 구축에 적합합니다.
