백시니아 바이러스 캡핑 효소

백시니아 바이러스 캡핑 효소는 백시니아 캡핑 효소에 대한 유전자를 운반하는 재조합 대장균 균주에서 파생됩니다.이 단일 효소는 두 개의 하위 단위(D1 및 D12)로 구성되며 세 가지 효소 활성(D1 하위 단위에 의한 RNA 트리포스파타제 및 구아닐릴트랜스퍼라제 및 D12 하위 단위에 의한 구아닌 메틸트랜스퍼라제)을 갖습니다.백시니아 바이러스 캡핑 효소는 7-메틸구아닐레이트 캡 구조(m7Gppp, Cap 0)를 ​​RNA의 5' 말단에 특이적으로 부착할 수 있는 캡 구조 형성을 촉매하는 데 효과적입니다.캡 구조(Cap 0)는 진핵생물에서 mRNA 안정화, 수송 및 번역에 중요한 역할을 합니다.효소 반응에 의한 RNA 캡핑은 시험관 내 전사, 형질감염 및 미세주입을 위한 RNA의 안정성과 번역을 크게 향상시킬 수 있는 효과적이고 간단한 방법입니다.

구성요소

백시니아 바이러스 캡핑 효소(10 U/μL)

10×캡핑 버퍼

보관 조건

-25~- 15℃ 보관 （반복적인 동결-해동을 피하십시오.）

저장 버퍼

20mM 트리스-HCl(pH 8.0), 100mM NaCl,

1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% 트리톤 X-100, 50% 글리세롤.

단위 정의

백시니아 바이러스 캡핑 효소 1단위는 37°C에서 1시간 내에 10pmol의 GTP를 80nt 전사체에 통합하는 데 필요한 효소의 양으로 정의됩니다.

품질 관리

엑소뉴클레아제:10U의 백시니아 바이러스 캡핑 효소와 1μg λ-Hind III 분해 DNA를 37℃에서 16시간 동안 처리하면 아가로스 겔 전기영동으로 측정한 결과 분해가 발생하지 않습니다.

엔도뉴클레아제:10U의 Vaccinia virus Capping Enzyme과 1μg λDNA를 37℃에서 16시간 동안 사용하면 아가로스 겔 전기영동으로 측정한 결과 분해가 발생하지 않습니다.

틈새:10U의 백시니아 바이러스 캡핑 효소와 1μg의 pBR322를 37℃에서 16시간 동안 사용하면 아가로스 겔 전기영동으로 측정한 결과 분해가 발생하지 않습니다.

RNase:10U의 Vaccinia virus Capping Enzyme과 1.6μg MS2 RNA를 37℃에서 4시간 동안 처리한 결과 아가로스 겔 전기영동으로 측정한 결과 분해가 발생하지 않았습니다.

1.대장균 DNA:E. coli 16S rRNA 유전자좌에 특이적인 프라이머가 포함된 TaqMan qPCR을 사용하여 10U의 Vaccinia 바이러스 캡핑 효소에서 E. coli 게놈 DNA의 존재 여부를 스크리닝합니다.E. coli 게놈 DNA 오염은 1 이하입니다. E. coli 게놈.

2.세균 내독소: LAL 테스트는 중국 약전 IV 2020 판, 겔 한도 테스트 방법, 일반 규칙(1143)에 따릅니다.세균 내독소 함량은 10 EU/mg 이하여야 합니다.

반응 시스템 및 조건

1. 캡핑 프로토콜(반응량: 20μL)

이 절차는 10μg RNA(≥100nt)의 캡핑 반응에 적용 가능하며 실험 요구에 따라 규모를 확장할 수 있습니다.

I) 1.5ml 마이크로퍼지 튜브에 10μg RNA와 뉴클레아제가 없는 H2O를 결합하여 최종 용량 15.0μL로 만듭니다.*10×캡핑 완충액: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) 65℃에서 5분간 가열한 후 얼음욕조에서 5분간 가열합니다.

3) 지정된 순서대로 다음 구성요소를 추가합니다.

*10×캡핑 완충액: 0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) 37°C에서 30분 동안 배양하면 이제 RNA에 캡이 씌워지고 다운스트림 적용을 위한 준비가 완료됩니다.

2. 5' 터미널 라벨링 반응 (반응량: 20 μL)

이 프로토콜은 5' 삼인산을 포함하는 RNA에 라벨을 지정하도록 설계되었으며 수요에 따라 확장될 수 있습니다.라벨 통합 효율성은 RNA:GTP의 몰비뿐만 아니라 RNA 샘플의 GTP 함량에 의해 영향을 받습니다.

1) 1.5ml 마이크로퍼지 튜브에 적절한 양의 RNA와 뉴클레아제가 없는 H2O를 혼합하여 최종 용량 14.0μL로 만듭니다.

2) 65℃에서 5분간 가열한 후 얼음욕조에서 5분간 가열합니다.

3) 지정된 순서대로 다음 구성 요소를 추가합니다.

** GTP MIX는 GTP와 소수의 마커를 의미합니다.GTP 농도에 대해서는 다음을 참조하십시오.참고 3에.

4) 37°C에서 30분 동안 배양하면 이제 RNA 5' 말단에 라벨이 지정되고 다운스트림에 대한 준비가 완료됩니다.

응용

1. 번역 분석/시험관 내 번역 이전에 mRNA 캡핑

2. mRNA의 5' 끝 부분에 라벨링

사용상의 주의사항

1.Vaccinia Capping Enzyme과 함께 배양하기 전에 RNA 용액을 가열하면 전사체의 5'말단에 있는 2차 구조가 제거됩니다.고도로 구조화된 5'엔드가 알려진 녹취록의 경우 시간을 60분으로 연장합니다.

2. 캡핑 반응에 사용되는 RNA는 사용하기 전에 정제되어야 하며 뉴클레아제가 없는 물에 현탁되어야 합니다.EDTA가 없어야 하며 용액에는 염이 없어야 합니다.

3. 5' 말단을 라벨링하는 경우 총 GTP 농도는 반응에서 mRNA 몰 농도의 약 1~3배여야 합니다.

4. 반응 시스템의 부피는 실제 상황에 따라 확대 또는 축소될 수 있습니다.