PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F)는 당단백질에서 거의 모든 N-결합 올리고당을 제거하는 가장 효과적인 효소 방법입니다.PNGase F는 N-결합 당단백질의 고만노스, 하이브리드 및 복합 올리고당의 가장 안쪽 GlcNAc와 아스파라긴 잔기 사이를 절단하는 아미다제입니다.
애플리케이션
이 효소는 단백질에서 탄수화물 잔류물을 제거하는 데 유용합니다.
준비 및 사양
| 모습 | 무색 액체 |
| 단백질 순도 | ≥95%(SDS-PAGE 기준) |
| 활동 | ≥500,000U/mL |
| 엑소글리코시다제 | 활동이 감지되지 않았습니다(ND). |
| 엔도글리코시다제 F1 | ND |
| 엔도글리코시다제 F2 | ND |
| 엔도글리코시다제 F3 | ND |
| 엔도글리코시다제 H | ND |
| 프로테아제 | ND |
속성
| EC 번호 | 3.5.1.52(미생물로부터의 재조합체) |
| 분자 무게 | 35kDa(SDS-PAGE) |
| 등전점 | 8. 14 |
| 최적의 pH | 7.0-8.0 |
| 최적의 온도 | 65°C |
| 기질 특이성 | GlcNAc와 아스파라긴 잔기 사이의 글리코시드 결합 절단 그림 1 |
| 인식 사이트 | α1-3 푸코스를 포함하지 않는 N-연결 글리칸 그림 2 |
| 활성제 | DTT |
| 억제제 | SDS |
| 보관온도 | -25 ~-15 ℃ |
| 열 불활성화 | 1μL의 PNGase F를 함유한 20μL 반응 혼합물은 75°C에서 10분 동안 배양하여 비활성화됩니다. |
그림 1 PNGase F의 기질 특이성
그림 2 PNGase F의 인식 위치
내부 GlcNAc 잔기가 α1-3 푸코스에 연결되면 PNGase F는 당단백질에서 N-연결된 올리고당을 절단할 수 없습니다.이 변형은 식물과 일부 곤충 당단백질에서 흔히 발생합니다.
C구성 요소
|
| 구성요소 | 집중 |
| 1 | PNGase F | 50μl |
| 2 | 10×당단백질 변성 완충액 | 1000μl |
| 3 | 10×글리코버퍼 2 | 1000μl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000μl |
단위 정의
1단위(U)는 총 반응 부피 10μL에서 37°C에서 1시간 동안 10μg의 변성 RNase B에서 탄수화물의 >95%를 제거하는 데 필요한 효소의 양으로 정의됩니다.
반응 조건
1. 1-20 µg의 당단백질을 탈이온수로 녹이고, 1 µl의 10×당단백질 변성 완충액과 H2O(필요한 경우)를 첨가하여 총 반응 부피를 10 µl로 만듭니다.
2.100°C에서 10분 동안 배양하고 얼음 위에서 식힙니다.
3.10×GlycoBuffer 2 2ul, 10% NP-40 2ul를 첨가하고 섞는다.
4.1-2 µl PNGase F 및 H 추가2O (필요한 경우)를 사용하여 총 반응 부피를 20 µl로 만들고 혼합합니다.
5.37°C에서 60분 동안 반응을 인큐베이션합니다.
6.SDS-PAGE 분석 또는 HPLC 분석용.
