mRNA Cap2'-O-메틸트랜스퍼라제

mRNA Cap 2' -O-메틸트랜스퍼라제는 우두 mRNA Cap 2'-O-메틸트랜스퍼라제에 대한 유전자를 운반하는 재조합 대장균 균주에서 유래되었습니다.이 효소는 RNA의 5'말단에 있는 캡 구조에 인접한 첫 번째 뉴클레오티드의 2'-O 위치에 메틸기를 추가합니다. 이 효소는 S-아데노실메티오닌(SAM)을 메틸 공여체로 활용하여 캡핑된 RNA(캡 -0) 결과적으로 cap-1 구조가 됩니다.

Cap1 구조는 번역 효율을 증가시켜 형질감염 및 미세주입 실험에서 mRNA의 발현을 향상시킬 수 있습니다. 이 효소는 특히 m7GpppN 캡을 기질로 갖는 RNA를 필요로 합니다.5' 말단에 pN, ppN, pppN 또는 GpppN이 있는 RNA를 활용할 수 없습니다.캡핑된 RNA는 캡 유사체를 사용한 시험관내 전사를 통해 또는 백시니아 캡핑 효소를 사용한 효소적 캡핑을 통해 제조될 수 있습니다.

구성요소

mRNA 캡 2'-O-메틸트랜스퍼라제(50U/μL)

10×캡핑 반응 버퍼

저장

-25 ～- 15℃ 보관 （반복적인 동결-해동을 피하십시오.）

저장 버퍼

20mM Tris-HCl(pH 8.0，25℃), 100mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 50% 글리세롤.

단위 정의

1 단위는 37°C에서 1시간 동안 80nt 캡핑된 RNA 전사체의 10pmole을 메틸화하는 데 필요한 효소의 양으로 정의됩니다.

품질 관리 분석

엑소뉴클레아제:50U의 mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase와 1μg λ-Hind III 분해 DNA를 37℃에서 16시간 동안 처리하면 아가로스 겔 전기영동으로 측정한 결과 분해가 발생하지 않습니다.

엔도뉴클레아제: 50U의 mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase와 1μg λDNA를 37℃에서 16시간 동안 아가로스 겔 전기영동으로 측정한 결과 분해가 발생하지 않았습니다.

니카제: 50U의 mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase와 1μg의 pBR322를 37℃에서 16시간 동안 첨가하면 아가로스 겔 전기영동으로 측정한 결과 분해가 발생하지 않습니다.

RNase: 50U의 mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase와 1.6μg MS2 RNA를 37℃에서 4시간 동안 처리한 결과 아가로스겔 전기영동으로 측정한 결과 분해가 발생하지 않았습니다.

E. 대장균 DNA: 50U의 mRNA Cap 2' -O-Methyltransferase가 존재하는지 스크리닝합니다.E. 대장균 특정 프라이머를 사용하여 TaqMan qPCR을 사용한 게놈 DNAE. 대장균 16S rRNA 유전자좌.그만큼E. 대장균 게놈 DNA 오염은 =1입니다.E. 대장균 게놈.

세균 내독소: LAL 테스트, 중국 약전 IV 2020 에디션, 겔 한도 테스트 방법, 일반 규정(1143)에 따름.세균 내독소 함량은 10 EU/mg이어야 합니다.

반응 시스템 및 조건

1. 1.5mL 마이크로퍼지 튜브에 적절한 양의 Capped RNA와 RNase-free H2O를 결합하여 최종 부피 16.0μL로 만듭니다.

2. 65℃에서 5분간 가열한 후 얼음욕조에서 5분간 방치한다.

3. 다음 구성요소를 지정된 순서대로 추가합니다(Capped RNA의 메틸화용).

10 미만

*10× 캡핑 반응 완충액: 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. 37℃에서 1시간 동안 배양합니다. (200 nt 미만의 타겟 단편은 2시간 배양을 권장합니다.)

응용

미세주입 및 형질감염 실험 중 mRNA 발현을 개선합니다.

사용상의 주의사항

1. 반응 전, RNA는 정제되어 뉴클레아제가 없는 물에 용해되어야 하며, 모든 용액에는 EDTA와 이온이 포함되어서는 안 됩니다.

2. 전사체의 5'말단에 있는 2차 구조를 제거하기 위해 반응 전 샘플 RNA를 65℃에서 5분간 가열하는 것이 좋습니다.복잡한 5' 터미널 구조의 경우 10분까지 확장될 수 있습니다.