이중 가닥 RNA(dsRNA) ELISA 키트

본 키트는 biotin-Streptavidin 시스템과 결합한 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)로, 서열에 관계없이 60 염기쌍(bp) 이상의 길이를 갖는 dsRNA를 정량 측정합니다.플레이트는 항-dsRNA 항체로 사전 코팅되어 있습니다.샘플에 존재하는 dsRNA가 첨가되고 웰에 코팅된 항체와 결합합니다.그런 다음 비오티닐화된 항-dsRNA 항체가 첨가되어 샘플의 dsRNA에 결합합니다.세척 후 HRP-Streptavidin을 첨가하고 Biotinylated 항-dsRNA 항체에 결합합니다.배양 후 결합되지 않은 HRP-Streptavidin은 세척되어 제거됩니다.그런 다음 TMB 기질 용액을 첨가하고 HRP에 의해 촉매작용을 하여 산성 정지 용액을 첨가한 후 노란색으로 변하는 파란색 생성물을 생성합니다.노란색의 밀도는 플레이트에 포획된 dsRNA의 목표 양에 비례합니다.흡광도는 450nm에서 측정됩니다.

애플리케이션

본 키트는 잔여 dsRNA를 정량적으로 측정하기 위한 키트입니다.

키트 구성품

보관 및 안정성

1. 미사용 키트의 경우: 키트 전체를 유효기간 동안 2~8℃에서 보관할 수 있습니다.보관 안정성을 위해 강한 빛은 피해야 합니다.

2. 사용한 키트의 경우: 마이크로플레이트를 개봉한 후 사용하지 않은 웰을 플레이트 실러로 덮은 후 건조제 팩이 들어 있는 호일 파우치에 넣고 지퍼로 밀봉한 후 사용 후 최대한 빨리 2~8℃로 되돌려 주세요.기타 시약은 사용 후 최대한 빨리 2~8℃로 되돌려 놓아야 합니다.

필요한 재료가 제공되지 않음

1. 450±10nm 필터가 있는 마이크로플레이트 리더(450 및 650nm 파장에서 감지할 수 있으면 더 좋음).

2. 마이크로플레이트 진탕기.

3. RNase가 없는 팁과 원심분리 튜브.

운영 흐름도

시작하기 전에

1. 키트의 모든 구성품과 샘플을 실온(18~25℃)에 보관한 후 사용하세요.키트를 한 번에 다 사용하지 않을 경우, 본 실험에 필요한 스트립과 시약만 꺼내고, 나머지 스트립과 시약은 필요한 상태로 두십시오.

2. 세척 완충액: 20× 농축 세척 완충액 40mL를 탈이온수 또는 증류수 760mL로 희석하여 1× 세척 완충액 800mL를 준비합니다.

3. 표준품: 사용 전 원액을 잠시 회전시키거나 원심분리합니다.제공되는 4가지 표준물질의 농도는 5ng/μL입니다.UTP 및 pUTP dsRNA 표준의 경우 STE 완충액을 사용하여 Stock Solution을 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL로 희석하여 표준 곡선을 그립니다.N1-Me-pUTP dsRNA 표준의 경우 STE 완충액을 사용하여 스톡 솔루션을 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL로 희석하여 표준 곡선을 그립니다.5-OMe-UTP dsRNA 표준의 경우 STE 완충액을 사용하여 스톡 용액을 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL로 희석하여 표준 곡선을 그립니다.표준품을 다음 차트에 따라 희석할 것을 권장합니다.

4. 비오티닐화된 검출 항체 및 HRP-스트렙타비딘 작업 용액: 사용하기 전에 원액을 잠시 회전시키거나 원심분리합니다.희석 완충액을 사용하여 작업 농도로 희석합니다.

5. TMB 하위 상태: 멸균된 팁을 사용하여 필요한 용량의 용액을 흡인하고 잔여 용액을 바이알에 다시 버리지 마십시오.TMB 기판은 빛에 민감하므로 TMB 기판을 오랫동안 빛에 노출시키지 마십시오.

프로토콜 사용

1. 분석에 필요한 스트립 수를 결정합니다.사용할 프레임에 스트립을 삽입합니다.이 분석에 사용되지 않은 남은 플레이트 스트립은 건조제와 함께 백에 다시 포장해야 합니다.냉장보관을 위해서는 봉지를 꼭 닫아주세요.

2. 표준물질, 바탕물질, 시료의 희석액 각각 100μL를 해당 웰에 추가합니다.플레이트 실러로 덮습니다.500rpm으로 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.정확한 분석을 위해 샘플을 적절한 농도로 STE 완충액으로 희석해야 합니다.

3. 세척 단계: 용액을 흡인하고 250μL 세척 완충액으로 각 웰을 세척하고 30초 동안 방치합니다.플레이트를 흡수성 종이에 끼워 세척 버퍼를 완전히 폐기합니다.총 4번 세탁하세요.

4. 각 웰에 100μL의 비오티닐화된 검출 항체 작업 용액을 추가합니다.플레이트 실러로 덮습니다.500rpm으로 흔들면서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

5. 세척 단계를 반복합니다.

6. 각 웰에 HRP-스트렙타비딘 작업 용액 100μL를 추가합니다.플레이트 실러로 덮습니다.500rpm으로 흔들면서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

7. 세척 단계를 다시 반복합니다.

8. 각 웰에 TMB 기질 용액 100μL를 추가합니다.플레이트 실러로 덮습니다.RT에서 30분 동안 배양합니다. 빛으로부터 보호합니다.기질 용액을 첨가하면 액체가 파란색으로 변합니다.

9. 각 웰에 정지 용액 50μL를 추가합니다.정지 용액을 첨가하면 액체가 노란색으로 변합니다.그런 다음 마이크로플레이트 리더를 실행하고 즉시 450nm에서 측정을 수행합니다.

결과 계산

1. 각 표준, 대조 및 샘플에 대한 중복 판독값의 평균을 계산하고 평균 0 표준 광학 밀도를 뺍니다.수직(Y) 축에 흡광도를, 수평(X) 축에 dsRNA 농도를 갖는 표준 곡선을 작성합니다.

2. 5 또는 4 매개변수 비선형 적합 모델에서는 곡선 전문가 1.3 또는 ELISA Calc와 같은 컴퓨터 기반 곡선 적합 소프트웨어를 사용하여 계산을 수행하는 것이 좋습니다.

성능

1. 감도:

검출 하한: ≤ 0.001pg/μL(UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA의 경우), ≤ 0.01pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA의 경우).

정량 하한: 0.0156 pg/μL(UTP-, pUTP-dsRNA의 경우), 0.0312 pg/μL(N1-Me-pUTP-dsRNA의 경우), 0.0625 pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA의 경우).

2. 정밀도: 분석 내 CV ≤10%, 분석 간 CV ≤10%

3. 회복: 80%~120%

4. 선형성: 0.0156-0.5pg/μL(UTP-,pUTP-dsRNA의 경우)0.0312-1pg/μL(N1-Me-pUTP dsRNA의 경우),0.0625-1pg/μL(5-OMe-UTP-dsRNA의 경우).

고려사항

1. TMB 반응 온도와 시간은 매우 중요합니다. 지침에 따라 엄격하게 제어하십시오.

2. 우수한 분석 재현성과 감도를 얻으려면 플레이트를 적절하게 세척하여 과도한 미반응 시약을 제거하는 것이 필수적입니다.

3. 모든 시약은 사용하기 전에 완전히 혼합되어야 하며 샘플이나 시약을 추가하는 동안 덩어리지지 않도록 해야 합니다.

4. 농축된 세척 완충액(20x)에 결정이 형성되면 37℃로 가열하고 결정이 완전히 녹을 때까지 가볍게 섞습니다.

5. 아지드화나트륨(NaN3)이 포함된 샘플 분석은 HRP 활성을 파괴하여 dsRNA 양을 과소평가할 수 있으므로 피하십시오.

6. 분석 중에 RNase 오염을 피하십시오.

7. 표준품/검체, 검출항체, SA-HRP도 흔들림 없이 실온에서 실시할 수 있으나 이로 인해 검출 민감도가 1배 정도 감소할 수 있습니다.이 경우, UTP 및 pUTP dsRNA 표준은 2pg/μL에서 희석해야 하며, N1-Me-pUTP dsRNA 표준은 4pg/μL에서, 5-OMe-UTP dsRNA 표준은 8pg/μL에서 희석해야 합니다.또한 HRP-스트렙타비딘 작업 용액을 실온에서 60분 동안 배양합니다.플라스크 셰이커를 사용하면 결과가 부정확해질 수 있으므로 플라스크 셰이커를 사용하지 마십시오.

일반적인 결과

1. 표준곡선 데이터

2. 표준곡선 계산

3. 라이너 감지 범위: 0.0312- 1pg/μL